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实时定量PCR
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    实时定量荧光PCRReal-time PCR)技术于1996年由美国ABI公司推出,由于该技术不仅实现了从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,具有特异性更强、更能有效的解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法????﹏▊。目前最常用的实时定量方法是染料(SYBR Green I)法和TaqMan探针法两种????﹏▊。实时定量荧光PCR技术已广泛应用于分子生物研究的各个方面,如:DNA定量、RNA定量、SNP分析、基因型分析、RNA变异分析等????﹏▊。

      百世诺医疗科技提供两种检测方法:即染料法和探针法????﹏▊。

  由客户提供该实验中目的基因的相关资料(如:基因名称、序列等信息),我们共同探讨服务的可能性和技术路线????﹏▊。

  商定服务收费、付款方式、服务期限等,签定技术服务合同????﹏▊。

  客户提供足量的实验样本(100mg组织或107个细胞),华大科技不接收RNA样本????﹏▊。

•  PCR所需引物/探针(如果用探针法),可以由客户提供,或委托本华大科技设计合成(费用另计)????﹏▊。如由客户提供,必须是PAGE纯化的高质量的干粉,不接收已溶解的引物/探针????﹏▊。

  百世诺科技进行RNA抽提、RNA定量、反转录、Real-time PCR扩增、数据分析????﹏▊。

•  百世诺科技提供实验报告,包括实验过程、所用仪器试剂、扩增曲线、标准曲线、熔解曲线和相关分析数据等????﹏▊。

1. 染料法(SYBR Green I

      SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料????﹏▊。与双链 DNA 结合后,其荧光大大增强????﹏▊。




由熔解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到的定量结果????﹏▊。




2TaqMan 探针法

      TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针,其荧光与目的序列的扩增相关????﹏▊。该探针与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,荧光基团连接在探针的 5’ 末端,而淬灭剂则在 3’ 末端????﹏▊。当完整的探针与目标序列配对时,荧光基团发射的荧光因与 3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭????﹏▊。但在进行延伸反应时,聚合酶的 5’ 外切酶活性将探针进行酶切,使得荧光基团与淬灭剂分离????﹏▊。 随着扩增循环数的增加,释放出来的荧光基团不断积累????﹏▊。因此,荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系????﹏▊。 相较于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性????﹏▊。



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